Новости

ПІГМЕНТОСИНТЕЗУВАЛЬНА АКТИВНІСТЬ БАКТЕРІАЛЬНИХ ТА ДРІЖДЖОВИХ КЛІТИН ЗА ДІЇ ВАЖКИХ МЕТАЛІВ

Работа добавлена:






ПІГМЕНТОСИНТЕЗУВАЛЬНА АКТИВНІСТЬ БАКТЕРІАЛЬНИХ ТА ДРІЖДЖОВИХ КЛІТИН ЗА ДІЇ ВАЖКИХ МЕТАЛІВ на http://mirrorref.ru

ПІГМЕНТОСИНТЕЗУВАЛЬНА АКТИВНІСТЬ БАКТЕРІАЛЬНИХ ТА ДРІЖДЖОВИХ КЛІТИН ЗА ДІЇ ВАЖКИХ МЕТАЛІВ

Крупєй К.С.

Запорізький національний університет 69600, Україна, Запоріжжя, вул. Жуковського, 66

Концентраційні інтервали між втратою пігменту та блокуванням росту в дріжджових клітинах коливалися в межах від 25 до 90%. Для бактерійSerratiamarcescensMP-141 концентраційні інтервали були лише для хлориду та сульфату цинку - 16,7 та 20% , відповідно. Дріжджові клітини виявилися чутливішими за бактеріальні щодо дії на них більшої частини важких металів і реагували втратою пігменту з менших концентрацій металів, ніж прокаріотичні клітини, тому їх можна рекомендувати для біоіндикації важких металів у довкіллі. Проте індикацію нітрату срібла та сульфату міді доцільніше проводити за допомогою бактерійS.marcescensMP-141 іPseudomonasfluorescensvar.pseudo-iodinum МР-11, а хлориду кадмію та цинку - з використаннямPs.fluorescensvar.pseudo-iodinum МР-11.

Ключові слова: бактерії, дріжджі, пігменти, важкі метали, біоіндикація.

Крупей К.С.ПИГМЕНТ СИНТЕЗИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ БАКТЕРИАЛЬНЫХ И ДРОЖЖЕВЫХ КЛЕТОК ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ / Запорожский национальный университет, 69600, Украина, г. Запорожье, ул. Жуковского, 66 Концентрационные интервалы между потерей пигмента и блокированием роста у дрожжевых клеток колебались в пределах от 25 до 90%. Для бактерийSerratiamarcescensMP-141 концентрационные интервалы были только для хлорида и сульфата цинка - 16,7 и 20% , соответственно. Дрожжевые клетки оказались чувствительнее, чем бактериальные, к воздействию большей части исследуемых тяжелых металлов и реагировали потерей пигмента из меньших концентраций металлов, чем прокариотические клетки, поэтому их можно рекомендовать для биоиндикации тяжелых металлов в окружающей среде. Индикацию нитрата серебра и сульфата меди целесообразнее проводить с помощью бактерийS.marcescensMP-141 иPseudomonasfluorescensvar.pseudo-iodinum МР-11, а хлорида кадмия и цинка - с использованиемPs.fluorescensvar.pseudo-iodinumМР-11.

Ключевые слова: бактерии, дрожжи, пигменты, тяжелые металлы, биоиндикация.

Krupey K.S. PIGMENT-SYNTHESIZING ACTIVITY OF BACTERIAL AND YEASTS CELLS UNDER THE INFLUENCE OF HEAVY METALS/Zaporizhzhya National University, 69600, Ukraine, Zaporizhzhya, Zhukovsky str. 66

The usage of the pigment-synthesizing bacteria as bioindicators is a new and promising tendency. Visual observation of the change of the pigment brightness under the influence of heavy metals (HM) and other xenobiotics may serve as objective bioindicator of the environment pollution. Thus, researches of the bacteria that we carried out aroused our interest to the research of the xenobiotics influence on the pigment-synthesizing ability of the yeast. In the literature accessible for us is mentioned only the fact that yeast have the ability to sorb HM, and there is little information about the ability to change the pigment color in HM and other xenobiotics presence in the medium. As is known, exceeding of the HM concentrations in nature has an adverse effect on the ecological state of the environment, which may lead to the malfunction of physiological and biochemical processes taking place in living organisms. And the surest and the most available methods of the anthropogenic violations diagnosis are based on a number of microbiological characteristics, because among all the representatives of the biota, microorganisms are the most sensitive to change of the medium.

Carotenoids, and especially p-carotene, act as antioxidants by reacting with active oxygen species and as anti-carcinogenic agents. For effective carotenogenesis, of vital importance is the use of: inexpensive alternative carbohydrate sources found in natural substrates, which typically are byproducts from various industries and tend to contaminate the environment; and strain-producers of high carotenoid-synthesizing activity.

Thus, the aim of our study was to investigate the influence of HM on the carotenoid synthesis of the yeasts Rhodotorula genus and to do a comparative analysis of influence of metals on prokaryotes and yeasts cells.

The object of the research was pigment-synthesizing yeast Rhodotorula genus and bacteria Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa. Solid nutrient medium was prepared on the base of the water with certain metals concentrations. Nutrient medium without substances was used as a control. When nutrient medium set congeal, 18-days cultures was seeded by solid lawn on it (0,2 ml per one Petri dish). Suspension density was 107/ml. Yeasts and bacteria incubated in the thermostat. Results were calculated on the 3d days of the cultivation. Visual observation and comparison of the experimental samples with the control was carried out. For the calculation of the color intensity difference between experimental and control samples, the Petri dishes with yeasts and bacteria colonies were photographed, photos were loaded in the program Adobe Photoshop, indexes of the color model channels (Lab), and then the difference of the pigment color intensity was calculated in the program CIEDE 2000.

The results of the research showed that the yeasts Rhodotorula genus and bacteria react on certain metal concentrations’ presence in the medium by the loss of pigment and by the growth delay. Comparative analysis of influence of metals on prokaryotes and yeasts showed that yeasts cells more expedient to use in bioindication researches, than prokaryotes (yeasts have almost for every metal a concentration interval between the loss of pigment and blocking of growth and able to react the loss of pigment from the less concentrations of metals).

The ability of microorganisms to loss the pigment in different concentrations of metals can be used in bioindication researches.

Key words: bacteria, yeasts, pigments, heavy metals, bioindication.

ВСТУП

Здатність до утворення пігментів у мікроорганізмів детермінована генетично і тому може використовуватися як ідентифікаційна ознака.

Продигіозин - один із кількох вторинних бактеріальних метаболітів, що мають незвичайну структуру, у якій метоксибіпірольний фрагмент включений у дипірометиленову структуру. Результати багатьох експериментів показують, що продигіозин діє як аутоокиснений акцептор, тим самим підтверджується його можлива участь у диханні мікроорганізмів. В утворенні продигіозину беруть участь амінокислоти. Припускають, що накопичення амінокислот у середовищі в період стаціонарної фази призводить до більш швидкої появи літичних процесів. Це припущення підтверджує спостереження, що пігментований штам має більш пізній автолітичний процес, ніж безпігментний. Утворення пігменту в цьому випадку можна розглядати як адаптивний процес, викликаний зміною фізіологічного стану клітини. Інша точка зору відносно біологічного значення пірилдіпірилметенових пігментів заснована на їх здатності пригнічувати в лабораторних умовах ріст мікроорганізмів. Великий інтерес становить спостереження, що екзогенний продигіозин є потужним сенсибілізатором для деяких мікроорганізмів [1, 2].

Піоцианін, який входить до класу феназинових пігментів, являє собою антибіотик бактерій видуPseudomonasaeruginosa; активний проти всіх грампозитивних бактерій. Механізм утворення феназинового кільця піоцианіну все ще не з’ясований, хоча це питання вивчали кілька груп учених. Ранні дослідиBlackwood іNaish [3] на зростаючих культурахPseudomonasaeruginosa показали, що гліцерин або діоксиацетон є кращими попередниками, ніж глюкоза, ацетат або фенілаланін. Ці дані дозволяють припустити, що піоцианін синтезується з проміжної сполуки, яка містить три вуглецеві атоми. Феназини, що синтезуються одним видом, можуть впливати на інші види та їхні тканини, причому цей вплив здійснюється різними шляхами. Вони одні з найперших бактеріальних продуктів, для яких була показана антибіотична активність проти інших мікроорганізмів. Бактеріостатичні властивості іодиніну та піоцианіну сьогодні вивчені детально. Є дані, що феназини володіють канцеростатичною активністю [4].

Іншою групою пігментів мікроорганізмів є каротиноїди, які належать до групи природних пігментів, забарвлених у жовтий, помаранчевий та червоний кольори. Специфічною ознакою каротиноїдів є наявність хромофора, що складається із низки кон’югованих подвійних зв’язків, кількість яких визначає характер забарвлення пігменту. Вони синтезуються рослинами, найпростішими, грибами та бактеріями.

Каротиноїдам притаманна антиоксидантна, протипухлинна та імуностимулювальна активності, аß-каротин є провітаміном жиророзчинного вітаміну групи А. З огляду на це, каротиноїди зазвичай використовуються у виробництві кормів для тваринництва, харчовій та фармацевтичній промисловості, косметології як природні барвники або харчові добавки [5-9].

Відомо, що каротиноїди, які входять до складу вегетативних клітинBacillus, мають жовте забарвлення, а пігменти спор - помаранчеве. Така здатність бактерій родуBacillus може бути використана для створення біосенсорів [7, 10]. Проте слід зазначити, що прокаріоти та одноклітинні еукаріоти є найменш вивченими з точки зору організмів-сигналізаторів забруднень. На сьогодні новим напрямком досліджень у біоіндикації є використання пігментосинтезувальних бактерій як біоіндикаторів [11]. Мікроорганізми найбільш чутливо реагують на зміни складу середовища та здатні швидко оновлювати біомасу, цим пояснюються переваги їх застосування в біоіндикаційних дослідженнях. Однак клітина прокаріот відрізняється від еукаріотичної клітини не тільки відсутністю ядра і багатьох органоїдів, але й спрощенням розмноження та особливостями дихання і харчування.

Тому метою нашої роботи було здійснити порівняльний аналіз олігодинамічної дії важких металів (ВМ), як одних із найпріорітетніших ксенобіотиків довкілля, на синтез пігменту прокаріотичних і одноклітинних еукаріотичних організмів.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Дріжджі родуRhodotorula культивували на твердому поживному середовищі Сабуро (бактерії - на МПА). У розплавлені середовища попередньо вносили солі ВМ (у перерахунку на катіон). Засівали мікроорганізми суцільним газоном методом Дригальського. Щільність суспензії становила 107 кл/см3. Культивування проводили в термостаті. Дріжджі та бактеріїSerratia marcescensкультивували за температури 28-29 0С,Pseudomonasaeruginosa - за 37 0С.

Облік результатів засівання бактерій на МПА з металами проводили візуально на 2 добу культивування (Ag+ - на 5 добу), дріжджів (та бактерій на середовищі МПА з сульфатом і хлоридом міді) - на 3 добу культивування, порівнюючи дослідні зразки з контролем. Для розрахунку різниці в інтенсивності кольору пігменту (dE) між дослідними чашками та контролем дріжджові колонії фотографували, розміщали фотографії в комп’ютерну програмуAdobePhotoshop. Потім визначали показники каналів кольорової моделі (Lab) і в програміCIEDE 2000 розраховували різницю в інтенсивності кольору пігменту [12]. Статистичну обробку проводили за допомогою комп’ютерних програм«Microsoft Office Excel2007» і«Statistica10».

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Серед пігментів можуть зустрічатися представники різних класів речовин: каротиноїди, феназинові барвники, піроли, азахінони, антоціани тощо, які здатні виконувати певні функції в клітині (табл. 1).

Дослідження показали, що концентраційні інтервали (КІ) між втратою пігменту та блокуванням росту простежувалися в дріжджових клітин і були в межах від 25 до 90% . Для бактерійS. marcescensКІ були лише для хлориду та сульфату цинку - 16,7 та 20% , відповідно (табл. 2). Дріжджові клітини виявилися дещо чутливішими за бактеріальні щодо дії на них більшої частини важких металів (табл. 3). Концентрації, з яких починалося блокування синтезу пігменту вRh. aurantiaca Y-1193,були набагато меншими, ніж у бактерійS. marcescens MP-141 (для біхромату калію, нітрату нікелю,хлориду кадмію, хлориду міді, хлориду та сульфату цинку в 3,5, 3, 2, 1,3, 1,25, 4 рази меншими, відповідно). Проте для сульфату міді та нітрату срібла, навпаки, концентрації, з яких блокувався синтез пігментів, були нижчими у Аmarcescens MP-141, ніж у дріжджів (у 2 та 3 рази, відповідно).

Таблиця 1 - Характеристика деяких груп пігментів мікроорганізмів

Ознака

Піролові похідні (продигіозин)

Феназинові

пігменти

(піоцианін,

іодинін)

Каротиноїди

Попередники синтезу

Амінокислота

пролін

Феназин-1,6-

дикарбонова

кислота

Фітоїн, фітофлюїн, лікопін

Смуги поглинання, нм

530-535 (у кислих

розчинах), 460470 (у лужних умовах)

400-600

280-550

Оптимальні

умови

утворення

пігментів

T,°С

28-30

37

28-30

pH

6,0-6,5

7,2

2-6

Речовини,

необхідні

для

синтезу

пігментів

Вітаміни (тіамін), аніониSO4 ", мікроелементи (Mg,Zn,Mn,Rb,Ca,Fe), амінокислоти (гліцин, аланін тощо)

Глюкоза, азот, фосфор; поживне середовище на основі бурякового відвару

Для дріжджів родуRhodotorula:глюкоза;

вуглець та азот (у співвідношенні 40:1)

Розчинність у воді

Не розчинні

Розчинні

Нерозчинні

Представники

продуцентів-

мікроорганізмів

Serratia marcescens, Actinomyces coelicolor, Act. longisporum, Act. Longispororu-ber

Види

Pseudomonas,

Streptomyces,

Brevibacte-rium,

Nocardia

Гриби(Mucoraceae),дріжджі

(Sporobolomycetacea),

актиноміцети

(Actinoplanaceae),

найпростіші

(DunaUeПaceae),

бактерії

(Micrococcaceae)

Біологічне значення

Беруть участь у диханні

Створюють окислювально- відновну пару, здатну до передачі електронів

Беруть участь у фотосинтезі, фототропізмі, фото- рецепції; володіють антиоксидантною активністю

Таблиця 2 - Значення концентраційного інтервалу між втратою пігменту та інгібуванням росту в мікроорганізмів під впливом важких металів

Солі важких металів

Культу

ри пігментосинтезувальних мікроорганізмів

Serratia

marcescens MP- 141

Rhodotorula

aurantiaca

У-1193

Pseudomonas fluorescens var. pseudo-iodinumМР-11

Rhodotorula glutinis У-1335

Концентраційні інтервали між втратою пігменту та блокуванням росту,%

K2Cr207

- *

-

-

75

№(N03)26^0

-

50

-

-

Cda2

-

90

-

62,5

AgN0з

-

25

-

-

СиСЬ^о

-

50

Не

досліджували

58,3

CuS04

-

50

-

-

Zna2

16,7

20

-

-

ZnS04

20

33,3

-

37,5

Примітка: -* - не спостерігалося концентраційного інтервалу.

Розрахунокрізницівінтенсивностікольорупігментупоказав,щозпідвищеннямконцентраціїметаліввсередовищізначення dEзбільшувалося (табл.4). Так, наприклад, за концентрації хрому 10 мг/дм3 спостерігався суцільний ріст рожево забарвлених колоній Аmarcescens MP-141, dE дорівнювала 4,0 ум. од. Повністю синтез пігменту блокувався за концентраціїСг6+ 70 мг/дм3, тому dE складала 18,6 ум. од. ДріжджіЯк. ажапкаса Y-П93 виявилися в 3,5 разу чутливішими відносно дії хрому на синтез пігменту, ніж Ататсе8сет MP-14, і втрачали здатність його синтезувати за концентрації металу 20 мг/дм3, dE була 19,1 ум. од.

Таблиця 4 - Вплив концентраційного ряду іонів металів на інтенсивність кольору пігменту в мікроорганізмів

1

2

3

4

Солі важких металів

Концен-

S. marcescens MP-141

Rh. aurantiaca Y-1193

трація

металу,

мг/дм<