Новости

БІОЛОГІЧНА АКТИВНІСТЬ КРІОКОНСЕРВОВАНОЇ СИРОВАТКИ КОРДОВОЇ КРОВІ В ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІЙ МОДЕЛІ ПОСТГІСТЕРЕКТОМІЧНОГО СИНДРОМУ

Работа добавлена:






БІОЛОГІЧНА АКТИВНІСТЬ КРІОКОНСЕРВОВАНОЇ СИРОВАТКИ КОРДОВОЇ КРОВІ В ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІЙ МОДЕЛІ ПОСТГІСТЕРЕКТОМІЧНОГО СИНДРОМУ на http://mirrorref.ru

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

Нардід Едуард Олегович

УДК:615.832.9:615.361.018.5.013.8:618.14-089.87

БІОЛОГІЧНА АКТИВНІСТЬ КРІОКОНСЕРВОВАНОЇ СИРОВАТКИ КОРДОВОЇ КРОВІ В ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІЙ МОДЕЛІ ПОСТГІСТЕРЕКТОМІЧНОГО СИНДРОМУ

  14.01.35 -кріомедицина

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Харків - 2010

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАНУкраїни.

Науковий керівник:

академік НАН України, доктор медичних наук, професор

Грищенко Валентин Іванович,Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, директор, м. Харків.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор

Юрченко Тетяна Миколаївна, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України,завідувач відділу кріоморфології,м. Харків.

доктор медичних наук, професор

Карпенко Володимир Геннадійович, Харківська медична академія післядипломної освіти МОЗ України, проректор з науково-педагогічної (міжнародної) роботи,м. Харків.

Захист відбудеться “___”_______________2010 р. о “______”годині на засіданні спеціалізованої вченої радиД 64.242.01 вІнституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків - 15, вул. Переяславська, 23).

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23).

Автореферат розіслано “______”__________________ 2010 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук, професоРозанов Л. Ф.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Фундаментальні дослідження в галузі сучасної кріобіології і кріомедицини дозволили розробити науково обґрунтовані методи кріоконсервування біологічних об'єктів. Застосування кріобіологічних технологій дає можливість розробляти нові препарати з наступним збереженням їх властивостей протягом тривалого часу [Цуцаєва А. О. та ін., 2000; Грищенко В. И. и др., 2002; Ліпіна О. В. та ін., 2003; Прокопюк О. С. и др., 2008]. Таке довгострокове зберігання дозволяє значно збільшити інтервал часу між етапом заготівлі матеріалу і його клінічним застосуванням, що дає можливість провести відповідні дослідження для виключення інфікування препаратів та створити їх запаси у кріобанках. Перспективними є методики кріоконсервування й наступного зберігання препаратів при температурі близько 80°С безпосередньо в лікувальних установах. Одержання нових ефективних біологічних препаратів - один із пріоритетних напрямків сучасної кріобіології і кріомедицини.

Стимулююча дія кордової (плацентарної) крові (КК) давно привернула увагу клініцистів. В наш час підвищився інтерес до застосування в клінічній практиці компонентів КК, зокрема, сироватки кордової крові(СКК). Використання досягнень кріомедицини і кріобіології мало величезне значення для вирішення проблеми збереження складу й властивостей компонентів КК[Грищенко В. І. та ін., 2000; Цуцаєва А. О. та ін., 2000]. Різні біологічні об'єкти вимагають індивідуальної технології кріоконсервування, а її розробка є одним з пріоритетних завдань кріобіології і кріомедицини. Актуальною є розробка оптимальних методик низькотемпературного консервування СКК, які дозволять максимально зберегти її біоактивні сполуки в нативному стані без порушення їх вихідного фізіологічного співвідношення, а також, – зберігати кріоконсервовану СКК безпосередньо в клініці. Індивідуальність підходу до розробки технологій низькотемпературного консервування СКК обумовлена особливостями біології даного матеріалу, пов'язаними, насамперед, з його специфічною плацентарною природою[Грищенко В. І. та ін., 2000; Ліпіна О. В. та ін., 2003]. Сироватка кордової крові є унікальною біологічно активною субстанцією. У ній міститься більше 60 специфічних плацентарних білків, які виконують роль ферментів, адаптогенів, рецепторів, факторів росту, імунорегуляторних агентів; цілий ряд пептидів структурних аналогів нейропептидів головного мозку, гормонів, вітамінів, мікроелементів [Морозова Р. П. и др., 1999; Милованов А. П. и др., 1999]. Кріоконсервовані препарати, отримані з елементів плацентарного комплексу, у тому числі й СКК, використовуються при лікуванні захворювань жіночої полової сфери, таких як ендометріоз, безплідність, гінекологічні запальні захворювання, станів, пов'язаних з порушенням гормональної рівноваги [Грищенко В. І. та ін., 2000; Цуцаєва А. О. та ін., 2003; Берегова Ю. П., 2003; Мошко  Ю. А., 2003; Прокопюк О. С. и др., 2008]. Поряд з цим існує проблема лікування постгістеректомічного синдрому (ПГС), який виникає у жінок, після видалення матки у фертильному віці. Останнім часом в Україні кількість таких пацієнток значно збільшилась. Більше 20% жінок у віці старше 18 років перенесли видалення матки, у тому числі 70% з них були прооперовані у віці від 30 до 40 років [Венцківський Б. М. та ін., 2000; Чайка В. К., 2001; Вихляева Е. М., 2004; Татарчук Т. Ф. та ін., 2005].

Відповідно до сучасних уявлень найважливішою ланкою патогенезу ПГС є гормональний дисбаланс внаслідок ішемії яєчників і порушення зворотних рецепторних зв'язків після видалення матки з наступними клінічними проявами естрогенної недостатності [Kaiser R. et al., 1989;Derksen J. G. et al., 1998; Краснопольский В. И. и др., 1998; Кулаков В. И. и др. 1999, Макаров О. В. и др., 2000; Краснова И. А. и др., 2001; Рубченко Т. И. и др., 2002; Доброхотова Ю. Э., 2003]. Отже, важливого значення в терапії ПГС набуває використання засобів, які володіють стимулюючою, гормонозамісною дією, до яких належать й біологічні препарати. Одним з таких препаратів може бути кріоконсервована СКК, застосування якої при даній патології дозволяє очікувати позитивного клінічного ефекту.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.Дисертаційна робота є складовою частиною наукових досліджень Інституту  проблем кріобіології і кріомедицини НАН України й виконана за темами: «Проведення наукових досліджень, розробка та втілення інформаційних, організаційних та технічних заходів, необхідних для збереження й використання наукового об'єкта - низькотемпературного банку біологічних об'єктів» (№ держреєстрації 0104U006441); «Дослідження впливу низьких температур і складу середовища на деякі елементи фетоплацентарного комплексу людини (клітини й плазма кордової крові, тканини плаценти та їх екстракти)» (№ держреєстрації 0101U003482); «Дослідження впливу низькотемпературної обробки тканини плаценти на біологічну активність її водно-сольових екстрактів відносно клітин різного походження» (№ держреєстрації 0106U002167), в яких автор виконував окремі розділи.

Мета і задачі дослідження. Мета дослідження - визначення впливу різних режимів кріоконсервування на збереження білкового складу СКК, структурно-функціональні властивості її білкових макромолекул, а також вивчення біологічної активності й ефективності СКК в експериментальній моделі постгістеректомічного синдрому.

Для досягнення мети були поставлені наступні задачі:

  1. Вивчити вплив швидкостей і кінцевих температур заморожування сироватки кордової крові, у тому числі і помірно низьких (80ºC), на розподіл білків за молекулярними масами.
  2. Вивчити  вплив заморожування-відігрівання на конформаційну динаміку білків сироватки кордової крові.
  3. Дослідити методом НВЧ-діелектрометрії гідратацію біомакромолекул сироватки кордової крові та її зміну під впливом низьких температур.
  4. Створити експериментальну модель постгістеректомічного синдрому.
  5. Вивчити біологічну активність кріоконсервованої і нативної сироватки кордової крові при її використанні в експериментальній моделі постгістеректомічного синдрому.

Об'єкт дослідження.Сироватка кордової крові.

Предмет дослідження.Зміни білкових компонентів СКК під впливом низьких температур, біологічна активність СКК (в експериментальній моделі ПГС).

Методи дослідження: спектрофотометрії, гель-хроматографії, ЕПР спінових зондів, електрофорезу, НВЧ-діелектрометрії, диференціальної скануючої калориметрії, морфології, імуноферментного аналізу.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше проведено дослідження впливу режимів і кінцевих температур заморожування на білковий спектр СКК. Комплексом методів (ЕПР спінових зондів, диференціальна скануюча калориметрія, НВЧ-діелектрометрія) встановлено, що після повільного заморожування й наступного відігрівання відбувається порушення конформації поверхневих поліпептидних ланцюгів білків СКК. Вперше показано, що повільне охолодження приводить до наступної агрегації білків сироватки, основну роль в якій відіграють сироватковий альбумін й імуноглобуліни. Визначено оптимальні швидкості заморожування СКК й температури довгострокового зберігання. Вперше досліджена можливість використання СКК для корекції гормональних порушень в експериментальній моделі ПГС. Доведено, що після використання кріоконсервованої при 80ºC СКК в експериментальній моделі ПГС нормалізується рівень фолікулостимулюючого гормону (ФСГ), лютеїнізуючого гормону (ЛГ) і естрадіолу. Вперше вивчена біологічна активність кріоконсервованої СКК в експериментальній моделі ПГС (у порівнянні з замісною гормональною терапією (ЗГТ)).

Практичне значення отриманих результатів. Проведене комплексне дослідження етапів низькотемпературного консервування СКК, яка є природною сумішшю білкових молекул, визначило підходи, що дозволяють узагальнено характеризувати стан білків у складі білкових сумішей і розробити практичні рекомендації для низькотемпературних банків щодо оптимальних режимів заморожування й кінцевих температур довгострокового зберігання білків й їхніх сумішей. Отримані результати дозволяють обґрунтувати економічно вигідне в порівнянні з температурою зрідженого азоту тривале зберігання препаратів СКК у морозильних камерах з температурою 80ºC зі збереженням їх високої біологічної активності й клінічної ефективності.

Результати, отримані при використанні СКК в експериментальній моделі ПГС, дозволяють очікувати ефект від клінічного застосування препаратів, створених на основі СКК, при розвитку ПГС.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійним дослідженням здобувача. Автором роботи сформульована мета і визначені задачі, проведені і проаналізовані експерименти, статистично оброблені результати, сформульовані висновки, які засновані на експериментальних даних. В опублікованих спільно зі співавторами працях особистий внесок здобувача полягає:

  • у роботах [1, 5, 6, 8, 9, 11, 12] у дослідженні впливу режимів заморожування СКК на зміну спектрів ЕПР сироватки;
  • у роботах [2, 7] у вивченні за даними гель-хроматографії та електрофорезу зразків СКК впливу швидкостей заморожування й температур зберігання СКК на розподіл білків за молекулярними масами;
  • у роботах [3, 10] у аналізі впливу низької температури на діелектричну проникність зразків СКК;
  • у роботах [4, 13, 14] у вивченні біологічної активності кріоконсервованої та нативної СКК в експериментальній моделі ПГС на підставі вмісту естрадіолу, ФСГ та ЛГ у периферичній крові до і після гістеректомії у самок щурів.

Апробація результатів дисертації.Матеріали дисертації повідомлені й обговорені наIX Українському біохімічному з'їзді (Харків,  2006), IV з'їзді Українського біофізичного товариства (Донецьк, 2006),представлені наV Міжнародному симпозіумі «Актуальні проблеми біофізичної медицини» (Київ, 2007), конференціях «Нові кріотехнології для рішення фундаментальних і прикладних завдань медицини» (Харків, 2008),«Досягнення та перспективи експериментальної і клінічної ендокринології» (Харків, 2010), «Актуальные вопросы акушерства, гинекологии и пеританологии» (Судак 2010).

Публікації. За темою дисертаційного дослідження опубліковано 14 робіт, з них 6 у спеціалізованих наукових журналах, включених до переліку, затвердженого ВАК України.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, розділу, присвяченого матеріалам і методам дослідження, двох розділів власних досліджень й  висновків. Робота викладена на 135 сторінках, містить 4 таблиці й 22 ілюстрації (графіки, діаграми). Список використаних літературних джерел складається з 227 найменувань викладений на 23 сторінках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Заготовлену за стандартною методикою кордову кров людини центрифугували у скляних флаконах при 2000-3000 об/хв протягом 30 хв, відокремлювали СКК, переносили її в стерильний скляний флакон. Отриману СКК розливали у стерильні одноразові поліетиленові контейнери об'ємом 1,0 мл.

З метою розробки оптимальних технологій низькотемпературного консервування СКК, що дозволяють максимально зберегти її склад і властивості, застосовували у дослідженнях наступні програми заморожування:

1 програма – до –196°С (швидкість охолодження близько 300-400°С/хв);

2 програма – до –80°С (швидкість охолодження близько 300-400°С/хв);

3 програма – до –80°С (швидкість охолодження близько 100°С/хв);

4 програма – до –80°С (швидкість охолодження близько 35°С/хв);

5 програма – до –80°С (швидкість охолодження близько 1-2°С/хв);

6 програма – до –20°С (швидкість охолодження близько 1-2°С/хв).

Розморожування СКК здійснювали при температурі 36±2°С.

Розподіл білків за молекулярними масами методом гель-хроматографії проводили на колонці 2х21см із сефадексом G-200. Концентрацію білка у фракціях визначали спектрофотометричним методом[Harris D. A., 1987]. Спектри поглинання записували на спектрофотометрі «Pye Uniсam SP 8000». Для електрофоретичнго аналізу компонентів СКК використовували апарат для горизонтального електрофорезу SE 2120 фірми «Solar» з програмним забезпеченням і блок електроживлення  РЕ 2120. Розподіл зразків проводили на пластинах з агаровим покриттям 108см. Електрофорез ( при силі струму 40 мА й напрузі 200 В) проводили протягом 20 хв. Як барвник використовували бромфеноловий синій. Денситометричний аналіз електрофореграм виконували на скануючому денситометрі ДМ 2120.

Для дослідження динамічної структури СКК застосовували метод ЕПР спінових зондів [Кузнецов А. И., 1976], використовуючи гідрофільний спіновий зонд ТЕМПОН, а також стеаринову кислоту, спін-мічену в 16 положенні уздовж гідрофобного ланцюга (16-ДС). Спін-мічені зразки сироватки містили по 100 мкМ зонда ТЕМПОН або зонда 16-ДС. Спектри ЕПР реєстрували на спектрометрі “Bruker” ER-100 (Німеччина) з температурною стабілізацією зразка. Були вивчені температурні залежності параметрів рухливості зондів у контрольних й розморожених зразках у діапазоні температур 0-40°С. Зі спектрів ЕПР зонда ТЕМПОН визначали інтенсивності центрального й бічного компонентів триплету й оцінювали параметр рухливості зонда. Як характеристики конформаційної динаміки сироваткових білків використовували значення параметра максимального розщеплення спектра ЕПР (2Амакс.), ширини центрального компонента спектра ЕПР зонда 16-ДС (ΔН0).

Дійсну частину комплексної діелектричної проникності ε′ при 20°С в інтервалі температур 4-40°С вимірювали на НВЧ-діелектрометрі резонаторного типу на частоті 9,2 ГГц. Температуру вимірювали за допомогою термопари з точністю ±0,1°С. Відносна помилка вимірів діелектричної проникності ε′ становила 0,15%.

Термограми СКК реєстрували на прецизійному диференціальному адіабатичному скануючому мікрокалориметрі DASM-4 (СКББП АН Росии, Пущино). Швидкість сканування температури становила 1°C/хв, надлишковий тиск – 2,5 атм. Помилка у визначенні температури денатурації домінантних білків сироватки Тd і ширини температурного інтервалу денатурації на напіввисоті пікаТdне перевищувала 0,5 й 1,0°C відповідно.

Для постановки експерименту було використано 120 статевозрілих самок щурів лінії Wistar масою 180-200 г, які утримувалися в стандартних умовах віварію Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України при нормальному освітленні й харчуванні ad libidum. Експериментальну роботу виконували відповідно до положень «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються для експериментальних та інших наукових цілей»(Страсбург, 1985) , а також до «Загальних етичних принципів експериментів на тваринах», схвалених Національним конгресом по біоетиці (2001).

Протягом 2 тижнів у щурів брали піхвові мазки для їх відбору. Відібрані тварини мали п'ятиденний естральний цикл і на момент початку експерименту перебували в стадії циклу dioestrous. При визначенні фаз естрального циклу у самок щурів використовували характерні морфологічні ознаки при мікроскопії піхвових мазків відповідно до опису [Киршенблата Я. Д., 1969].

Всі тварини були прооперовані на стадії циклу dioestrous. Гістеректомію в самок щурів виконували під наркозом. Черевну порожнину розкривали розрізом по середній лінії живота довжиною 4-5 см. Кожен ріг матки був виведений і покладений на вологу серветку. Маточно-яєчникова артерія й вена були перев’язані. Після цього кожен матковий ріг був відсічений. Після контролю гемостазу передня черевна стінка ушивалася наглухо вікрилом. Шов обробляли 5% спиртовим розчином йоду[Ozdamar S., 2005].

При розрахунку доз препаратів використовували константи біологічної активності [Рыболовлев Ю. Р., 1979] за формулою:

    D1 = R1 D2 / R2,

де D1 – доза для людини;

    R1 – коефіцієнт видової витривалості для людини;

    D2 – доза для тварини;

    R2 – коефіцієнт видової витривалості для тварини.

Доза 17 β-естрадіолу для однієї тварини склала 0,02 мг, доза СКК 0,02 мл на добу. Естрадіол вводили внутрішньом’язово один раз на добу протягом 30 діб, СКК – внутрішньом’язово один раз на добу протягом 10 діб.

Тварини були розподілені на шість груп:

1 група (n=20) – без лікування після видалення матки (контрольна група);

2 група (n=20) – після гістеректомії проведення ЗГТ (17 β-естрадіол );

3 група (n=20) – введення нативної СКК;

4 група (n=20) – введення СКК після заморожування до –196ºС зі швидкістю300-400°С/хв;

5 група (n=20) – введення СКК після заморожування до –80ºС зі швидкістю300-400°С/хв;

6 група (n=20) – введення СКК після заморожування до –80ºС зі швидкістю300-400°С/хв і наступного зберігання при цій температурі протягом 3 місяців.

Кров для визначення рівня гормонів забирали із хвостової вени тварин. Вміст ФСГ, ЛГ й естрадіолу у сироватці крові визначали імуноферментним методом аналізу за допомогою аналізатора Stat Fax 303 Plus (США). Для визначення вмісту естрадіолу у сироватці крові використовували гормональні тест-набори для твердофазного імуноферментного аналізу in vitro (ООО «Хема-Медика», Москва, Россия), а ФСГ і ЛГ – гормональні тест-набори для твердофазного імуноферментного аналізу in vitro (ЗАО «Алкор- Био», Санкт-Петербург, Россия).

Статистичну обробку отриманих результатів проводили на персональному комп'ютері, використовуючи пакети програм Statistika v5.5 й Origin 6.0.Оцінка статистичної значимості показників і розходжень розглянутих вибірок проводилась з використанням параметричного критерію Стьюдента й непараметричного критерію Манна-Уітні, при рівні значимості не нижче p<0,05.

Результати досліджень та їх обговорення

У результаті проведених досліджень визначено, що використані режими заморожування й наступного відігрівання СКК приводять до зміни температурних залежностей параметрів конформаційної динаміки білків сироватки. На рис. 1 представлені результати досліджень методом ЕПР спінових зондів впливу різних режимів заморожування на конформаційну динаміку білків сироватки.

Представлені дані демонструють певні відмінності дії на СКК різних режимів заморожування, що проявляється як у максимальному розщепленні, так й у ширині центрального компонента спектра ЕПР. Так, повільне заморожування сироватки до –20°С приводить до більших змін максимального розщеплення й ширини центрального компонента спектра ЕПР зонда 16-ДС. Це свідчить про значну модифікацію динамічної структури білків, що має характер розпушення. Швидке заморожування зразків сироватки не викликає значних змін динаміки мікрооточення радикалів.

Таким чином, при такому режимі заморожування білки СКК залишаються в стані, близькому до нативного. Але й при заморожуванні СКК з високими швидкостями зміни параметрів спектрів ЕПР можуть бути обумовлені збільшенням доступності розчиннику більш глибоких порожнин білків.

Підтвердженням порушення конформації білкових молекул сироватки при повільному заморожуванні є дані, отримані методом калориметрії.

                              а                                                                б

Рис. 1. Температурні залежності параметрів спектрів ЕПР (максимального розщеплення (а), ширини центрального компонента (б)) зонда 16-ДС, пов'язаного з білками СКК (n=6):

1 – нативна СКК;

2 – СКК після заморожування до –20°С;

3 – СКК після заморожування до –196°С.

На рис. 2 наведені криві теплопоглинання СКК після різних режимів заморожування в порівнянні з нативним зразком. Процес теплопоглинання (рис. 2) відбувається в температурному інтервалі 40-100°C. Крива теплопоглинання нативного зразка характеризується різким й інтенсивним піком (Тd=62,50,5°C), а також слабко вираженим піком при температурі 840,5°C. Враховуючи дані літератури [Хачидзе Д. Г] пік (Тd=62,50,5°C) можна приписати денатурації знежиреного альбуміну, плечі на кривій теплопоглинання – денатурації трансферину (Тd66°C) та імуноглобуліну G (Тd72°C), а пік (Тd=840,5°C) – денатурації незнежиреного альбуміну. Виходячи з термограм представлених на рис. 2, можна стверджувати, що альбумін у складі СКК, у тому числі і після її заморожування, перебуває в основному в знежиреному стані, тобто його центри зв'язування в значній мірі вільні від лігандів і можуть відігравати важливу рольin vivo.

Заморожування СКК з високими швидкостями не викликає істотної зміни кривої теплопоглинання (рис. 2). У той же час після заморожування сироватки з низькою швидкістю спостерігається зміщення піка денатурації знежиреного альбуміну в зону низьких температур. Таке зниження температури денатурації альбуміну вказує на зміну конформації, імовірно, поверхневих поліпептидних ланцюгів макромолекул, це приводить до більш раннього процесу теплової денатурації при нагріванні СКК.

Відомо, що агрегація білків при заморожуванні-відігріванні відноситься до поверхнево-індукованих процесів і відбувається внаслідок розгортання білків на поверхнях розділу лід-вода й вода-повітря [Foster P. R., Williams R. O.].

Рис. 2. Калориметричні записи теплопоглинання СКК (n=6):

1 нативна СКК;

2 –СКК після заморожування до20ºСзішвидкістю 1-2град/хв;

3 –СКК після заморожування до–196ºСзішвидкістю300-400град/хв.

Розпушення білків може сприяти їх розгортанню на поверхнях розділу й стимулювати агрегацію. Враховуючи отримані методом ЕПР і калориметрії дані про те, що при заморожуванні СКК з повільними швидкостями відбувається розпушення поверхневих поліпептидних ланцюгів білкових молекул сироватки, доцільно було дослідити виникнення агрегації в цих умовах.

Методом гель-хроматографії вивчено вплив різних режимів заморожування на білковий спектр СКК (рис. 3). Дослідження складу білків СКК замороженої за програмою 6 показали, що максимуми на гель-хроматограмі зміщені в зону більших молекулярних мас, це може свідчити про агрегацію біомакромолекул сироватки при такому режимі заморожування. З рис. 3 видно, що відбувається зменшення вмісту білків з молекулярною масою ~65 кДа одночасно зі збільшенням вмісту білків з молекулярними масами ~120 та 300 кДа. Зменшення вмісту білків в низькомолекулярних фракціях свідчить про те, що, імовірно, і вони можуть частково приймати участь у процесі агрегації. Заморожування СКК за програмою 5 ще більше змінює розподіл білків за молекулярними масами і супроводжується появою більших агрегатів (збільшення вмісту білків з молекулярною масою ~700 кДа й вище).

Рис. 3. Гель-хроматограми СКК нативної і після заморожування-відігрівання (n=6): нативна СКК;       СКК після заморожування до –80°C зі швидкістю 300-400°C;  СКК після заморожування до –80°C зі швидкістю 100°C;  СКК після заморожування до –80°C зі швидкістю 35°C;  СКК після заморожування до –80°C зі швидкістю 1-2°C;  СКК після заморожування до –20°C.

Хроматограма сироватки, замороженої за програмою 4, практично не відрізняється від хроматограми сироватки, замороженої зі швидкістю 1-2°C/хв до цієї ж температури. Після заморожування СКК за програмою 3 характер її гель-хроматограми наближається до нативної СКК, а відмінності свідчать про участь в агрегації в основному низькомолекулярних білків. Агрегування, очевидно, у цьому випадку практично відсутнє. Принаймні, основні за кількістю білки сироватки (альбумін й імуноглобуліни), в агрегації не беруть участі. Виявлено аналогічні відмінності в гель-хроматограмах нативної сироватки й сироватки, попередньо замороженої за програмами 1 і 2.

Наведені вище результати щодо впливу режимів заморожування на агрегацію білків сироватки до